Ядром всех версий ОС MS-DOS вплоть до 6.22 включительно является файл MSDOS.SYS. Ссылка на него в корневом каталоге должна быть второй по счету, и этот файл загружается при запуске системы также вторым. В состав этого файла входят подпрограммы, управляющие доступом ОС к дискам и файлам. Как и файл IO.SYS, MSDOS.SYS загружается в основную память системы и хранится в ней в течение всего времени работы компьютера. Если этот файл потерян или поврежден, то появится сообщение об ошибке в процессе загрузки или система просто зависнет.
С появлением ОС Windows 95 (а затем и Windows 98) классические файлы DOS были переработаны для того, чтобы упростить процесс загрузки системы. Все подпрограммы, входившие ранее в файлы IO.SYS и MSDOS.SYS, в ОС Windows 95/98 сгруппированы в одном скрытом файле под названием IO.SYS (при загрузке компьютера под управлением прежней операционной системы этот файл может быть переименован в WINBOOT.SYS). Большинство параметров насфойки системы, которые ранее задавались в файле CONFIG.SYS, в ОС Windows 95/98 имеют значения по умолчанию, определенные программным кодом файла IO.SYS. Параметры по умолчанию, заданные в IO.SYS, могут быть изменены путем введения в файл CONFIG.SYS соответствующих команд.
Файл MSDOS.SYS в Windows 95/98 претерпел существенные изменения. Если в прежних версиях MS-DOS дисковые и файловые операции базировались на программных кодах, входивших в файл MSDOS.SYS, то в ОС Windows 95/98 все эти подпрофаммы были перенесены в файл IO.SYS. Файл MSDOS.SYS в ОС Windows 95/98 — не более чем текстовый INI-файл, используемый для настройки параметров загрузки Windows и содержащий список путей к ключевым файлам Windows (в том числе и к файлам реестра). Если нет необходимости в корректировке процесса загрузки ОС, то менять что-либо в этом файле не нужно.